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Apr 12, 2023

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El innovador diseño de escaneo láser desbloquea alta precisión

El innovador diseño de escaneo láser desbloquea observaciones de alta precisión de hasta 10 000 cuadros por segundo, lo que convierte al microscopio en una poderosa herramienta de registro

SPIE--Sociedad Internacional de Óptica y Fotónica

imagen: Mediante la combinación de dos modos de escaneo láser, los investigadores han desarrollado un sistema versátil de microscopía de dos fotones que se puede utilizar para observar procesos biológicos extremadamente rápidos a altas velocidades de cuadro y resolución espacial.ver más

Credit: Le et al., doi 10.1117/1.NPh.10.2.025006.

La microscopía de dos fotones (TPM) ha revolucionado el campo de la biología al permitir a los investigadores observar procesos biológicos complejos en tejidos vivos a alta resolución. A diferencia de las técnicas de microscopía de fluorescencia tradicionales, TPM utiliza fotones de baja energía para excitar las moléculas fluorescentes para su observación. Esto, a su vez, permite penetrar mucho más profundamente en el tejido y garantiza que las moléculas fluorescentes, o fluoróforos, no sufran daños permanentes por el láser de excitación.

Sin embargo, algunos procesos biológicos son simplemente demasiado rápidos para ser registrados, incluso con TPM de última generación. Uno de los parámetros de diseño que limita el rendimiento de un TPM es la frecuencia de exploración de línea, medida en fotogramas por segundo (FPS). Esto se refiere a la velocidad a la que el láser de excitación puede barrer la muestra objetivo en una dirección (por ejemplo, en un barrido horizontal). Una frecuencia de escaneo lenta también afecta el FPS general del sistema, ya que determina qué tan rápido se puede barrer el láser en la otra dirección, es decir, en un barrido vertical. Juntos, estos crean un compromiso entre la resolución temporal del microscopio y el tamaño del marco de observación.

Para solucionar este problema, un equipo internacional de investigadores de China y Alemania desarrolló recientemente una poderosa configuración de TPM con una frecuencia de escaneo de línea sin precedentes. Según su informe publicado en Neurophotonics, este sistema de microscopía fue diseñado para obtener imágenes de procesos biológicos rápidos con una alta resolución temporal y espacial.

Uno de los factores clave que distinguen al TPM propuesto de los convencionales es el uso de deflectores acústico-ópticos (AOD) para controlar el escaneo del láser de excitación. Un AOD es un tipo especial de cristal cuyo índice de refracción se puede controlar con precisión mediante ondas acústicas. Esto, a su vez, nos permite redirigir un rayo láser a través de él como se desee. Más importante aún, los AOD permiten una dirección del láser más rápida que la que se obtiene con los galvanómetros utilizados en los TPM convencionales.

En consecuencia, el equipo diseñó un AOD personalizado con una velocidad acústica excepcionalmente alta utilizando un cristal de dióxido de telurio (TeO2), logrando una alta frecuencia de exploración de línea. Con este AOD, el láser podría escanear una línea en el cuadro en tan solo 2,5 microsegundos, lo que corresponde a una frecuencia máxima de escaneo de línea de 400 kHz. De manera similar, el equipo usó un AOD para lograr una frecuencia de exploración lenta razonable en la otra dirección.

Para mejorar aún más la adaptabilidad de su microscopio, el equipo agregó la opción de cambiar a un mecanismo de escaneo láser basado en galvanómetro cuando sea necesario. Esto permitió el escaneo de grandes regiones de la muestra a una resolución y velocidad aceptables, lo que facilitó la localización de pequeñas áreas de interés antes de cambiar al escaneo AOD.

El equipo realizó varios experimentos de prueba de concepto con el TPM de nuevo diseño. Instalaron ventanas craneales en ratones modificados genéticamente y las usaron para observar la morfología y la actividad de las neuronas, así como el movimiento de glóbulos rojos (GR) individuales. El sistema logró una velocidad de fotogramas de hasta 10 000 FPS utilizando una configuración AOD y un tamaño de fotograma adecuados. Esto fue suficiente para medir con precisión la velocidad a la que se propaga el calcio en las dendritas neuronales, así como para visualizar la trayectoria de los glóbulos rojos individuales dentro de los vasos sanguíneos.

Impresionada por estos resultados, la Dra. Na Ji, editora asociada de Neurophotonics y Luis Alvarez Memorial Chair in Experimental Physics en UC Berkeley, comenta: "El nuevo sistema de microscopía de barrido basado en AOD representa una mejora sustancial en la velocidad y el rendimiento de las imágenes, como se demostró en su aplicación para la propagación de señales de calcio y mediciones de flujo sanguíneo en el cerebro in vivo".

En el futuro, el nuevo diseño TPM de prueba de concepto hará posible capturar procesos biológicos rápidos y podría mejorar significativamente nuestra comprensión de ellos.

Lea el artículo Gold Open Access de Li et al., "Imágenes de microscopía de dos fotones de diez kilohercios de la actividad dendrítica de una sola célula y la hemodinámica in vivo", Neurophotonics10(2), 025006 (2023), doi 10.1117/1.NPh.10.2.025006.

neurofotónica

10.1117/1.NPh.10.2.025006

Imágenes de microscopía de dos fotones de diez kilohercios de la actividad dendrítica de una sola célula y la hemodinámica in vivo

3-mayo-2023

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